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激光掃描共聚焦顯微鏡的原理和應用
發布時間 : 2021/05/04 信息來源 :新華社區

激光掃描共聚焦顯微鏡的原理和應用


1激光掃描共聚焦顯微鏡的基本原理和發展

科學研究工作對更高圖像分辨率的追求產生了激光掃描共聚焦顯微鏡 。隨著免疫熒光技術在生物學研究領域的廣泛應用,研究人員注意到,熒光顯微照片的分辨率較低,傳統的熒光顯微鏡使用場光源,因標本鄰近結構(細胞或亞細胞結構)產生的衍射光和散射光的幹擾,使標本中細微結構的成像不夠清晰 。激光共聚焦顯微鏡的主要原理是利用激光掃描束通過光柵針孔形成點光源,在熒光標記標本的焦平麵上逐點掃描,采集點的光信號通過探測針孔到達光電倍增管(PMT),再經過信號處理,在計算機監視屏上形成圖像 。由於激光光源的光柵針孔和探測針孔對物鏡焦平麵是共軛的,焦平麵上的點同時聚焦於光柵針孔和探測針孔,進行點掃描時,掃描點以外的點不會成像,經逐點掃描後才形成整個標本的光學切片(Optic section

早期的激光掃描共聚焦顯微鏡采用的是掃描速度較快的狹縫掃描方式,由於其在平行狹縫的光軸麵上無共聚焦原理,圖像分辨率不高,而被淘汰 。隨後發展起來的是階梯式掃描技術,它克服軸外像差,平行移動工作台來逐點掃描標本,提高了圖像分辨率,但是對標本製備要求太高,也難於成為成熟的技術 。現在的激光掃描共聚焦顯微鏡采用的是驅動式光束掃描器,具有掃描速度較快和符合共聚焦原理的特點 。目前激光掃描共聚焦顯微鏡的光源設計和分光采集技術也有較大的改進 。首先是激光器的快速發展,使得現代的激光掃描共聚焦顯微鏡可以根據研究需要選擇不同的激光器,如Ar UV (351,364nm),HeCd(442nm),Ar(457,488,514nm),ArKr(488,568,647nm),Kr(568nm),HeNe(543nm),HeNe(633nm)等 。選擇激光光源時,一方麵要滿足研究工作對波長的需求,另一個方麵要考慮到激光光源的壽命 。其次是近年來對於激光束分光和熒光采集原理也有較大的突破,目前大部分激光掃描共聚焦顯微鏡仍采用選擇性波長濾片輪進行分光和熒光采集(見圖2),這樣的裝置完全與傳統的熒光顯微鏡一樣使用激發波長.


2 .共焦顯微鏡與傳統顯微鏡的區別

1. 抑製圖像的模糊 。獲得清晰的圖像




2. 具有更高的軸向分辨率 ,並可獲取連續光學切片 。



3. 由於點對點掃描去除了雜散光的影響 。


3 激光掃描共聚焦顯微鏡的主要生物學應用

3·1 組織和細胞中熒光標記的分子和結構的檢測標本製備方法主要有免疫熒光組織和細胞化學法 、熒光蛋白標記分子法 、熒光細胞染料標記法等 。與傳統的熒光顯微鏡相比,除了有較高的分辨率以外,一個主要的不同是激光掃描共聚焦顯微鏡可以利用激光點掃描成像,形成所謂的“光學切片”,進而可以利用沿縱軸上移動標本進行多個光學切片的疊加形成組織或細胞中熒光標記結構的總體圖像,因此可以用於觀察切片和一些表麵不平的標本,特別是研究具有長突起的神經元時更有使用價值 。同時可以做三維圖像重建和標記強度的半定量分析 。

3·2 定量或半定量測量Ca2+和pH等細胞內離子濃度及變化利用Fluo-3 、Fura 2等熒光探針可以測量Ca2+在活細胞內的濃度及變化 。一般來說,電生理記錄裝置加攝像技術檢測細胞內離子量變化的速度相對較快,但其圖像本身的價值較低,而激光掃描共聚焦顯微鏡可以提供更好的亞細胞結構中鈣離子濃度動態變化的圖像,這對於研究鈣等離子細胞內動力學有意義 。最好與電生理等技術相結合來觀察離子變化與電生理學指標的相關性 。

3·3 熒光光漂白及恢複技術

利用高能量激光束將細胞內某一部分中選定靶區域的某種熒光淬滅,然後觀察鄰近相同的熒光標記物重新擴散入該區域的速度和方式,從而分析細胞內蛋白質運輸 、受體在細胞膜上的流動和大分子組裝等細胞生物學過程 。一般來說,需要用熒光蛋白等標記物標記需要研究的分子,進行細胞轉染表達後再做以上的實驗 。

3·4 長時程觀察細胞遷移和生長

目前激光掃描共聚焦顯微鏡的軟件一般均可自動控製地進行定時和定方式的激光掃描,而且由於新一代激光掃描共聚焦顯微鏡的探測效率的提高,隻需要很小的激光能量就可以達到較好的圖像質量,從而減小了每次掃描時激光束對細胞的損傷,因此,可以用於數小時的長時程定時掃描,記錄細胞遷移和生長等細胞生物學現象 。

3·5 其他的生物學應用

用高能量激光束進行細胞損傷和損毀實驗,一般要用紫外激光束進行細胞損毀;細胞間通訊研究;光解籠鎖活化技術等 。

結語

激光掃描共聚焦顯微鏡作為一項全新的實驗手段和強有力的研究工具 ,為凱時首頁解決一些以往研究工作中不能解決的技術難題創造了條件 ,因而必將得到更為廣泛的應用 。隨著新軟件的不斷開發及各個學科 [11-12] 的不斷發展和相互滲透 ,相信它還將會有更廣闊的發展前景 。